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检验男人不孕的实验室方法

  许多不孕不育症的原因都是在男方的身上。而因为精子的问题造成不孕不育是其中常见的病因。抗精子抗体就是精子的一个“毒物”。他让精子的质量变差,导致精子不能和卵子结合,孕育出生命。

  抗精子抗体与精子结合后,在补体参与下,可导致精子制动和死亡,利用台盼蓝或伊红Y 等染料使死精子染色,间接验证血清或分泌液中是否有制动精子的抗体存在。

  (一) 台盼蓝染色法

  【准备】

  (1) 待检血清的分离和灭活补体。

  (2) AB血型人血清(补体)制备。

  (3) 2%台盼蓝液配制(用蒸馏水)。

  (4) 台盼蓝-生理盐水溶液配制:取适量生理盐水,加等体积2%台盼蓝水溶液,混匀即可。

  (5) 配制0.01 mol/L,pH 7.4 PBS溶液。

  【方法】

  (1) 取正常新鲜精液[精子浓度为(40~ 100)×106/mL]用pH7.4 PBS作1∶10稀释,以500r/min 30min离心洗涤一次,弃去上清,沉渣用PBS调整精子浓度为100×106/mL 的精子悬液。

  (2) 在小试管内加入1滴待检血清,1滴精子悬液和 2滴补体血清。置37℃ 孵育,并于30min、60min分别追加2滴补体血清,直至90min后加入 1滴台盼蓝生理盐水溶液,继续孵育 60min,取出小试管,以500r/min,30min离心,弃去上清,将沉渣涂片,待干燥后镜下观察。以阴性血清作对照组,以同样条件和方法处理

  (3) 计数:对照组:记录数至100个无染色精子(活精子)时所需的总精子数(含100个无染色精子加一定数量染色的死精子)。实验组:记录对照组相应的总精子数,把其中所含的无染色精子(活精子)数作X。将100-X所得的数目,即为被检血致死的精子数,这个数目称为精子毒性指数(STI)。

  【判断】

  STI>25时,P≤0.01,判为阳性。STI在 15~ 20之间,判为可疑。STI<15时,判为阴性。本法所得阳性率与精子制动试验的阳性率较为一致。

  (二) 伊红Y染色法

  【准备】

  (1) 用蒸馏水配制4% 伊红 Y 染液。

  (2) 配制0.01mol/L,pH7.4 PBS溶液。

  【方法】

  (1) 取正常新鲜精液(精子浓度宜大于:60×106/mL),用pH 7.4的 PBS洗涤 3次,调整精子浓度为10×107/mL。

  (2) 取精子悬液16μL,移置载玻板的漆孔内,分别设2个测定和对照孔,另取待检血清20μL,补体血清4μL 加入测定孔内,对照孔只加待测血清不加补体,充分混匀。

  (3) 把玻板移入湿盒内,在37℃孵育30min,每孔加4%伊红Y 4μL,加上盖玻片使其作用 2min,进行镜检。

  【判断】

  由于活精子不着色,死精子着染为红色,计算200个精子中,死精子所占的百分数,减去对照组死精子的百分数,即为抗体杀灭精子的百分率。以杀灭精子≥10% 以上者为阳性。


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